一、请求的目的

水中大肠菌群的测定采用膜法。

二、基本原则

滤膜法是利用过滤器过滤水样，将细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在合适的培养基上进行培养，大肠菌群可以直接在膜上生长，所以可以直接计算。所用滤膜为多孔硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，为水性滤膜，孔径约为0.45μm。

三、测试原材料和设备

实验材料：一红梅蓝琼脂平板或远藤琼脂平板、倒置小套管乳糖蛋白胨发酵管）、灭菌水、河水或湖水；

设备：镊子；夹子；烧杯；真空泵；滤膜；过滤器等

四、操作步骤

1.滤膜杀菌

将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，加热煮沸15分钟，共煮沸3次。煮沸两次后，水洗2-3次，然后煮沸以洗去滤膜上的残留溶剂。

2.过滤装置

无菌过滤器底座、过滤膜、漏斗和过滤瓶安装在无菌程序中，用无菌镊子将过滤膜转移到过滤器底部（浸入95%酒精中，火焰灭菌）。其他的可以直接用手或夹子操作，但不要触摸伸入过滤瓶的橡胶塞部分，以免污染。

3. 将过滤瓶连接到真空泵。

4.加水样过滤

对于直径为50mm的过滤器，要过滤的水量一般需要较多的过滤装置，50个以上的过滤器为宜。因此，最好使用多重过滤器，这样可以减少错误。一般可抽取300-500毫升的深井水或处理过的河水、湖水；比较干净的河水或湖水可以取样1-100ml；严重污染的水样可以先稀释；可以对未知的水样进行采样。进行三个稀释，并为要计算的菌落数选择适当的稀释。在这个实验中，将100毫升相对干净的河水或湖水加入过滤漏斗并加盖。

5. 启动真空泵进行油过滤。

6、抽完后，加入等量的无菌水，继续过滤，以冲洗漏斗壁。

7. 过滤后关闭真空泵，用无菌镊子夹住过滤器的边缘，将没有细菌的一面放在 Endo 琼脂板或 Espresso blue 琼脂板上。过滤器和介质之间不得有气泡。

8. 将板倒置并在 37°C 下孵育 22-24 小时。

9. 挑取符合大肠菌群特征的菌落，进行革兰氏染色和镜检。

10.显微镜下，革兰氏阴性、无芽孢杆菌的菌落接种于乳糖蛋白发酵管中，37℃培养24小时。产酸产气组大肠菌群呈阳性。